長居植物園の園内の一角にあり、大阪の生いたちや、縄文・弥生時代人の自然とのかかわりなど、最近の発掘調査をもとに興味深く展示・解説されている、自然史系の専門博物館。
大阪府下で出土した恐竜の骨格標本や各種の貴重なコレクションももち、規模は国立科学博物館に次ぐものだ。
とくに、恐竜の骨格標本やナガスクジラの骨は迫力満点。
またドングリの生死を分けるボールコースターやスマートボールで学ぶ島へのシュミレーションなど、｢生き物のくらし｣をゲームや映像で楽しく学べる展示もある。
館外には植物園があり、200万年前に大阪に生育していたと思われる植物や、縄文時代の平地照葉樹林帯がつくられている。また自然観察会などの野外活動も活発に行っている。

自然史系博物館の中でもアクティビティの高い博物館として評されることが多く、
その活動を支える最も大きな要素は大阪市立自然史博物館友の会である。
自然史学の初心者からハイ・アマチュア、プロに至る多くの市民が友の会に参画し、学芸員や会のコアメンバーが会員の自然観察会や調査研究活動を支援・主導している。